5月19日,《Cell Discovery》在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海巴斯德研究所郝沛研究員，利用RNA編輯策略、編輯干預(yù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的合作研究論文:“Interfering with retrotransposition by two types of CRISPR effectors: Cas12a and Cas13a”。該研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生命周期中具有DNA和RNA兩個(gè)不同階段的特性，首次采用RNA編輯的策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1（類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的模式生物）的編輯干預(yù)。同時(shí)，該工作還第一次采用CRISPR-Cas12a對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體的DNA階段進(jìn)行編輯，達(dá)到了100%的編輯干預(yù)效率。 

　　 該研究開拓了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體（包括外源的逆轉(zhuǎn)錄病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）進(jìn)行編輯干預(yù)的新思路。為RNA編輯和DNA編輯技術(shù)應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染阻斷、器官移植中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒失活、和種質(zhì)資源培育中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子抑制，提供了新的技術(shù)策略和并建立了系統(tǒng)參數(shù)。 

　　近年來，CRISPR系統(tǒng)開始發(fā)展成為對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病原體（包括外源的逆轉(zhuǎn)錄病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）非常有前途的重要技術(shù)。外源和內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒是引發(fā)人體疾病的嚴(yán)重起因，也是器官移植（同種和異種器官移植術(shù)）中重大的風(fēng)險(xiǎn)因素。導(dǎo)致疾病的著名外源和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括HIV-1，HTLV-1，HERV-K 等等。前期科學(xué)家嘗試用CRISPR-Cas9編輯消除病人體內(nèi)的HIV-1，抑制作為器官移植供體的豬體內(nèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERVs），和消除水稻育種中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 Tos17的干擾，取得了一定的進(jìn)展。 

　　雖然近年來發(fā)現(xiàn)的、專門靶向編輯RNA的 CRISPR第VI亞型 Cas13，為對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體的編輯干預(yù)，提供了新的可能性和技術(shù)策略。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生命周期中具有DNA和RNA兩個(gè)不同階段的特性，理論上RNA編輯的方法可以通過編輯RNA中間體，有效干預(yù)和對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病原體，但這一技術(shù)策略迄今為止尚沒有被探索過。另外，近年來發(fā)現(xiàn)與CRISPR-Cas9類似、作用于DNA的CRISPR第V亞型Cas12a，具有一些優(yōu)秀特性，包括對(duì)PAM區(qū)的不同要求、自處理產(chǎn)生crRNA的能力、和更高的靶向效率。但到目前為止尚沒有Cas12a應(yīng)用于編輯干預(yù)逆轉(zhuǎn)錄病原體的報(bào)道。本研究卻在以下幾個(gè)方面做出了突破性貢獻(xiàn)。 

　　構(gòu)建了Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的報(bào)告系統(tǒng)：  

　　為了應(yīng)用RNA編輯（利用Cas13a）的技術(shù)策略和Cas12對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體編輯干預(yù)，郝沛課題組與合作者首先構(gòu)建了Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的報(bào)告系統(tǒng)。他們?cè)?span>Tf1的NEO基因中引入了反向的內(nèi)含子（構(gòu)建多達(dá)4種不同的內(nèi)含子序列），這樣Tf1轉(zhuǎn)錄剪接后新形成的Tf1產(chǎn)物、將不具有這些引入的內(nèi)含子。然后通過設(shè)計(jì)crRNA，在實(shí)驗(yàn)中特異性靶向這些新形成的不包含內(nèi)含子的Tf1產(chǎn)物。   

　　首次證明RNA編輯顯著干預(yù)抑制Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性： 

　　郝沛課題組與合作者設(shè)計(jì)了Cas13靶向Tf1中間轉(zhuǎn)錄本的兩個(gè)特異位點(diǎn)和隨機(jī)對(duì)照的實(shí)驗(yàn)，獲得了對(duì)Tf1轉(zhuǎn)座活性的16%和60%的顯著編輯抑制效果。這些結(jié)果第一次證明了RNA編輯是對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體有效的干預(yù)策略。更進(jìn)一步，對(duì)比Cas13a與靶標(biāo)結(jié)合被激活后（由于其亂切割活性）導(dǎo)致原核宿主細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的現(xiàn)象，研究者沒有觀察到Tf1在真核宿主中激活導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)的現(xiàn)象。這暗示了RNA編輯技術(shù)在真核宿主的安全性，也表明Cas13a在真核細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞中的作用機(jī)制有所不同。 

　　第一次采用CRISPR-Cas12a實(shí)現(xiàn)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體DNA階段進(jìn)行編輯干預(yù)： 

　　通過設(shè)計(jì)Cas12a靶向Tf1逆轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)特異位點(diǎn)（5個(gè)crRNA設(shè)計(jì)）和隨機(jī)對(duì)照的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cas12a對(duì)Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的顯著編輯抑制作用（達(dá)到90%）--雖然仍有殘余的Tf1轉(zhuǎn)座發(fā)生。研究者猜測(cè)殘余的轉(zhuǎn)座活性，是由于Tf1中間產(chǎn)物被VLP包裝保護(hù)的結(jié)果。 所以更進(jìn)一步，通過延長(zhǎng)crRNA的表達(dá)時(shí)間，最終完全消除了殘余轉(zhuǎn)座活性，達(dá)到了100%的編輯干預(yù)效率。 

　　這些研究成果，開拓了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行編輯干預(yù)的新思路和新方法。比較了RNA編輯和DNA編輯的不同作用機(jī)制，完成了兩類機(jī)制對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病原體復(fù)制和轉(zhuǎn)座的編輯干預(yù)效果的定量分析，為新技術(shù)策略發(fā)展建立了基礎(chǔ)并提供了系統(tǒng)參數(shù)。  

　　該項(xiàng)研究工作由中科院上海巴斯德所郝沛研究員與中科院分子植物卓越中心合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李軒研究員、美國密歇根大學(xué)王紅兵（Hongbing Wang）教授合作完成。張牛冰和荊新云為為共同第一作者。相關(guān)工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院戰(zhàn)略先導(dǎo)項(xiàng)目、和自然科學(xué)基金項(xiàng)目的支持。 

　　文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41421-020-0164-0