12月7日，中國科學院上海免疫與感染研究所晁彥杰研究員在國際學術期刊Nature Communications發(fā)表了題為In vivo RNA interactome profiling reveals 3'UTR-processed small RNA targeting a central regulatory hub的研究論文。該研究開發(fā)了一項全新的RNA互作組高通量研究技術（iRIL-seq），使用該技術能在微生物活細胞內(nèi)快速鑒定RNA-RNA分子間相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)現(xiàn)新的基因調(diào)控機制。該研究首次繪制了沙門氏菌不同生長時期的RNA互作網(wǎng)絡圖譜，發(fā)現(xiàn)了許多新型非編碼RNA和重要的mRNA調(diào)控中樞。

　　細胞內(nèi)RNA-RNA互作是非編碼RNA發(fā)揮功能的核心機制之一。在原核微生物細胞中，非編碼小RNA通過十分簡短且不完美的堿基互補配對識別靶標mRNA，其分子互作難以使用常規(guī)方法進行準確預測與鑒定。原核非編碼小RNA具有重要的調(diào)控功能，在轉(zhuǎn)錄后水平控制眾多靶基因的翻譯表達，在細菌感染致病、抗生素耐藥、營養(yǎng)代謝、壓力應激、群體感應與生物膜合成等許多生物學過程中發(fā)揮著關鍵作用，因此解析RNA-RNA互作網(wǎng)絡對于研究微生物生理生化與非編碼RNA功能機制有重要意義。然而，現(xiàn)有的RNA-RNA互作組研究技術實驗體系復雜、步驟繁多、周期長且失敗率高，需要固定細胞后在體外進行RNA末端酶切、修復與連接等上百步操作，RNA互作鑒定的準確性和分辨度不足。 

　　該研究開發(fā)了一種全新的體內(nèi)RNA鄰近連接技術iRIL-seq（intracellular RNA interaction by ligation and sequencing）。該技術通過在微生物活細胞中誘導表達T4 RNA連接酶，促使RNA-RNA互作分子之間發(fā)生鄰近連接；借助非編碼小RNA結合Hfq伴侶蛋白的特點，使用免疫共沉淀富集Hfq和與之結合的眾多非編碼小RNA及其互作分子；最終通過高通量測序鑒定所有捕獲的RNA分子與序列特征，主要實驗流程可在1天內(nèi)完成。該技術既實現(xiàn)了對微生物RNA-RNA分子互作網(wǎng)絡的全景式解析，也能在單核苷酸水平鑒定RNA-RNA堿基互作位點信息，具有高度的靈敏性和特異性，為解析不同微生物中的RNA互作圖譜提供了一種簡單、快捷、準確的通用性技術，也為研究真核細胞中的RNA分子互作提供了新的思路。

圖1：微生物活細胞RNA鄰近連接技術iRIL-seq實驗流程

　　利用iRIL-seq技術，該工作首次繪制了腸道模式病原菌—沙門菌多個生長時期的動態(tài)RNA互作網(wǎng)絡圖譜，鑒定了2000多個RNA-RNA互作關系，首次提出了mRNA調(diào)控中樞的概念，證明編碼外膜桶蛋白OmpD的mRNA是目前規(guī)模最大的調(diào)控中樞，至少受到12個不同非編碼小RNA的調(diào)控。進一步對這些小RNA進行實驗鑒定，發(fā)現(xiàn)了一個經(jīng)mRNA 3’UTR剪切加工產(chǎn)生的新型小RNA FadZ。FadZ及其親本fadBA mRNA的表達受到上游轉(zhuǎn)錄因子FadR、CRP和長鏈脂肪酸信號的調(diào)控。在長鏈脂肪酸條件下，F(xiàn)adZ sRNA與其靶基因ompD均由轉(zhuǎn)錄因子CRP激活，共同構成I型不連貫前饋回路（I1-FFL），拓展了細菌應對宿主長鏈脂肪酸代謝壓力的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。

圖2：iRIL-seq鑒定的ompD mRNA調(diào)控中樞和新型小RNA FadZ的功能機制

　　晁彥杰研究員為該論文的通訊作者，復旦大學上海醫(yī)學院王川副教授為共同通訊作者；中國科學院上海免疫與感染研究所博士后劉方為論文第一作者，聯(lián)合培養(yǎng)研究生陳梓瀅為論文共同第一作者。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項、中國科學院國際合作局、上海市科技重大專項、中國博士后基金會等項目支持。

　　文章鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43632-1

　　課題組介紹:

　　微生物RNA系統(tǒng)生物學研究組（負責人：晁彥杰研究員）以人體重要病原菌和共生菌為研究對象（如腸道沙門菌、肺炎克雷伯菌等），利用獨特的高通量測序技術和功能基因組實驗方法，鑒定新型的非編碼小RNA、RNA結合蛋白并解析其功能與機制，加深對微生物感染致病、耐藥持留、宿主互作和共生機制的認識。課題組主持承擔多項國家級人才與科研項目，在Nature, Mol Cell, Nature Comm, EMBO J, EMBO Mol Medicine, Trends in Microbiol, Emerging Microb & Infections等國際期刊發(fā)表30多篇高水平論文，引用超過6000次。